七鳃鳗，一种“史前”甘旨，给单碱基编纂器的优化带来了希望。
- 编者案 -
毫无疑问，基因编纂是当前最为炽热的一个研究范畴。那篇文章解释了时下最为欢送的基因编纂东西 CRISPR 的工做机造，并解释了单碱基编纂器的呈现为何是基因编纂范畴的一个打破。
而关于单碱基编纂器来说，脱氨基酶决定其平安性和适用范畴。比来，仇子龙及其团队从一种比恐龙还要古老的寄生生物身上得到灵感，通过挑选多样化的胞嘧啶脱氨基酶，构建出一系列新的胞嘧啶碱基编纂器（CBEs），使其平安性和适用范畴得到了优化和拓展。 撰文 | 程田林
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写在前面的话：DNA与基因
要领会基因编纂，需要对DNA与基因有充实的认识。我们拆修本身的房屋，需要有设想图纸，按照图纸来循序渐进地完成拆修。形象一点而言，DNA就是人体的设想图纸，人体如何搭建，端赖DNA指引。绘造房屋设想图纸，最根本的即是两种线条：曲线，弧线；人体的设想图纸DNA最根本的则是四种碱基：ATGC。房屋设想图纸中，通过线条的组合，我们能够描画出版房、厨房、卧室、餐厅等等；通过碱基的组合，我们能够设想出搭建人体所需要的各类卵白量及RNA，对应着卵白量及RNA的碱基组合即是基因；基因描画的，其实就是人体的“书房”、“厨房”、“卧室”、“餐厅”等等。房屋设想图纸出错，我们能够通过橡皮或是批改液加以矫正。基因出了错，我们该若何矫正？基因编纂东西就是负责批改基因的东西。为了矫正房屋设想图纸，我们希望能有更好用的橡皮或批改液，更好能平安无痕；我们不竭地开发优化基因编纂东西，当然也是希望能平安无痕的矫正出错的基因。 一、CRISPR-Cas9系统的降生
生物学研究能够看做是 “寻宝” 之旅，每名研究者都在寻找本身眼中的 “宝藏”。良多时候，预期的 “宝藏” 未能寻到，却在不经意间开启了 “藏宝洞”。CRISPR-Cas9 系统的发现就是如许的不测。 1987年，大阪大学的 Yoshizumi Ishino 及其同事正存眷于大肠杆菌的iap基因，他们已经完成了该基因的测序工做。根据莫诺&雅各布的乳糖把持子理论，基因的上下流很可能有调控元件的存在（图1A）。于是，Yoshizumi Ishino 也就瓜熟蒂落地对iap基因的上下流序列停止了测序。只是，他们没有寻找到预期的 “宝藏”——调控元件，而是发现了无法破解的密码——五段反复的DNA序列。想象一下跨栏角逐的栏杆，研究者发现了五个栏杆（反复的DNA序列），栏杆之间是长度不异但序列差别的DNA片段（图1B）。那种特征的序列是前无前人的，研究者很懵。当然，他们仍是写了文章，描述了那一奇异的发现，但没人晓得那意味着什么 [1]。
图1. 乳糖把持子根本构造及CRISPR-Cas位点的发现过程
到了二十世纪九十年代，测序手艺不竭前进，研究者们在微生物的基因组中不竭发现类似的特征序列，当然，照旧无人晓得那些序列的奥秘。2002年，乌得勒收大学的 Ruud Jansen 团队决定从头阐发那类序列，看看能否能“挖宝”。 起首，那类序列有了名字，叫做 “规律成簇的间隔短回文反复”（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。CRISPR 的名号自此而始。他们还发现，CRISPR 序列能够转录成 RNA；并且序列附近似乎老是有类似的基因相伴，于是那些基因就叫做Cas（CRISPR-associasted），Cas编码的卵白能切割 DNA（图2）[2]。至此，CRISPR-Cas 系统成型，但它存在的意义仍然是一片空白。 后来，研究者发现，CRISPR 序列跟某些噬菌体（那是一种传染细菌的病毒）基因组的部门序列很婚配。至此，细菌与噬菌体被联络在了一路。此时，进化生物学家 Eugene Koonin入场：他整合了关于 CRISPR-Cas 系统的所有碎片化信息，指出，CRISPR-Cas 系统是细菌的免疫系统，是细菌匹敌病毒的兵器 [3]。 进化生物学家做完预测就已经完成使命。不外听者有意。微生物学家Rodolphe Barrangou 很喜好那个理论，就去设想尝试加以验证。成果发现 Koonin 的理论竟然是对的！也就是说，被噬菌体传染后，细菌会通过 CRISPR-Cas 系统切割噬菌体的基因组以保留证据；若是细菌能幸运存活，面临同样的噬菌体传染时，它们就能操纵已有的证据覆灭噬菌体以庇护本身 [4]。 此时，CRISPR-Cas 系统的功用根本确定，但详细的细节仍然有待研究。此时关键人物 Jennifer Doudna 与 Emmanuelle Charpentier 入场，恰是她们的研究让我们大白了 CRISPR-Cas 系统抵御外敌入侵的详细机造，也让基因编纂成为了可能。详细而言，那一机造可分为三步： 第一步是Cas卵白复合物对外敌DNA的识别，保留证据（长度为30-50bp的外敌DNA（被称做原型间隔序列））在本身的基因组（CRISPR位点）中（图2，步调1-2）。 第二步是 CRISPR 位点的转录，最末构成两条短链的 crRNAs（CRISPR来源的RNAs）和 tracerRNA（反式感化的crRNA）。此中 crRNAs 负责照顾外敌信息，那是 CRISPR-Cas 系统识别并匹敌外敌入侵的根底（图2，步调3）。 第三步是肃清入侵的外敌 DNA。若是 CRISPR-Cas 系统是兵器，前两步比如兵器零件的造造，那一步就是兵器的组拆：Cas9 卵白、crRNA 和 tracerRNA 构成整体，此中 crRNA 比如对准镜，切确造导，Cas9 卵白则像一把剪刀，去剪断被锁定的外敌 DNA（图2，步调4-5）。[5-6]
图2 CRISPR-Cas抗病毒的根本原理（来自http://www.scienceinschool.org）。 各人都欣喜若狂！CRISPR-Cas 系统能肃清外敌 DNA，是因为 crRNA 的序列与外敌 DNA 序列婚配。若是改动对准镜 crRNA 的序列，使之婚配其它物种的基因组序列，岂不是指哪打哪？ 颠末不竭的优化，指哪打哪的 CRISPR-Cas9 兵器实的降生了（图3）[7]。
图3 CRISPR-Cas9基因编纂手艺的根本原理（J.D.Sander etal. 2014） 二、DNA单碱基编纂器的降生
最起头，CRISPR-Cas9 是剪刀，剪断 crRNA 对准的基因组位点。但是，两把剪刀不嫌多，有三把更好。研究者们各显神通，“魔改” 系统，将 CRISPR-Cas9 系统打形成了十八般兵器：好比，剪刀太尖利，就把剪刀磨钝，只让 CRISPR-Cas9 系统负责定位或是在基因组上留下缺口，而不要完全割断基因组；要想调控基因的转录，就给钝剪刀加上转录调理器；要想精修基因组，就给钝剪刀加上各样的修剪器。 我们都晓得，DNA 序列是由四种差别的碱基构成，通过差别的排布，即可以贮藏丰硕的信息。若是有特定的碱基改动，其贮藏的信息也会发作改动。那么，CRISPR-Cas9 系统能否被革新成精准改动特定碱基的兵器？细胞内有一类酶，叫做碱基脱氨基酶，此中有两种，一是胞嘧啶脱氨基酶，它能够让胞嘧啶（C）酿成尿嘧啶（U），而U在基因组中会被替代成胸腺嘧啶（T），从而能实现碱基的改动（C->T）（图4A）；另一类是腺嘌呤脱氨基酶，它能够让腺嘌呤（A）酿成次黄嘌呤（I），在基因组中I阐扬鸟嘌呤（G）的功用，从而能实现碱基的改动（A->G）（图4B）。 而将磨钝的 CRISPR-Cas9 系统与脱氨基酶组合，研究者获得了可实现碱基转换的新兵器——单碱基编纂器（Baseeditors，BEs）。介导 C->T 改动的被称为胞嘧啶碱基编纂器（CBEs）[8]，而介导A->G改动的被称为腺嘌呤碱基编纂器（ABEs）[9]。不外单碱基编纂器有两大问题，一是对准镜的范畴小，有的位置瞄不到；二是有脱靶，不小心会改动其它位置的碱基，从而引发平安风险 [10]。
图4 脱氨基酶与碱基转换（改自H.A.Rees etal. 2018） 三、单碱基编纂器的深度演化
要革新优化单碱基编纂器，改换差别的脱氨基酶是可行的策咯。CBE 系统中常用的脱氨基酶别离来自卑鼠的 APOBEC1，人的 AID1 和七鳃鳗的 PmCDA1，它们有着类似的编纂范畴。天然界能否还有另类的脱氨基酶存在？那需要深切发掘。 在挖矿一般的查找文献和数据库后，中国科学院脑科学与智能手艺卓越立异中心研究员仇子龙及其团队发现，七鳃鳗中有着相当多样的胞嘧啶脱氨基酶（图5）[11]，值得深切摸索。
图5 三种七鳃鳗中的胞嘧啶脱氨基酶及大鼠APOBEC1和人源AID的序列比对（Cheng et al.2019） 七鳃鳗，是一种比恐龙还要古老的寄生生物，它们在地球上的保存时间已经超越3.6亿年。做为寄生生物，七鳃鳗有吸血狂魔的恶名（图6）。在美食家眼中，七鳃鳗却又享有盛名：它的甘旨曾经让英王亨利一世无法自拔，并最末吃的太多，腹胀而死。
图6 七鳃鳗的卡通图及实物图 如许一种 “史前” 甘旨，给单碱基编纂器的优化带来了希望。 七鳃鳗会表达多种差别的胞嘧啶脱氨基酶，并且差别种的七鳃鳗所含的酶功用各有差别[11]。那些多样化的酶与 CRISPR/Cas 系统组合后极大的拓展了 CBEs 的活性范畴，那让对准范畴更广，极大地丰硕了单碱基编纂的东西箱。好像乐高积木一样，通过差别的组合战略，我们获得了一系列的 CBEs，它们有着差别特色的对准镜，使得活性范畴愈加多样化，从而有着差别的适用场景，那让东西箱中的CBE 东西愈加丰硕，在利用上也有了更大的选择余地（图7）[12]。此外，新添加的 CBE 东西在平安性上也有了明显的改善，那为单碱基编纂手艺的应用供给了更多选择，新的胞苷脱氨酶也为将来单碱基编纂东西的开发和改善供给了根底。
图7：CBE系统的分类（Cheng et al. 2019）CBE 系统的活性窗口定义为 sgRNA 中编纂效率>40%的C位点。（a）前置型CBE（FSCBEs），其活性窗口次要位于sgRNA靶位点的前端（PAM位点看做最末端）。（b）后置型 CBE（BSCBEs），活性窗口次要位于 sgRNA 靶位点的后端。（c）广谱型 CBE（BRCBEs），活性窗口横跨 sgRNA 靶位点的前后端。 单碱基编纂手艺有着相当普遍的应用（图8），它在动物模子的构建、疾病治疗、做物育种以及点突变挑选等等多个方面都极具潜力 [13]。开发平安性高、适用范畴广的单碱基编纂东西将有助于其潜力的兑现，从而更好的办事于生物医学研究。新的 CBE 东西在平安性和适用范畴上均获得了相当大的前进，为单碱基编纂手艺的前进做出了奉献。
图8 单碱基编纂手艺的应用前景 （改自K.A.Molla et al. 2019）
做者简介程田林博士，助理研究员，中国科学院脑科学与智能手艺卓越立异中心，中国科学院神经科学研究所
